烟酸的终末代谢物会促进血管炎症并增加心血管疾病风险

摘要

尽管已经加强预防心血管疾病(CVD)，个体仍会存在心血管疾病风险。烟酸是主食中的必需营养元素，但其在心血管疾病中的作用尚不清楚。本研究的非靶向代谢组学分析表明，烟酸代谢与主要不良心血管事件(MACE)有关。两个验证队列结果显示，过量烟酸的终末代谢物2PY和4PY水平与3年MACE风险增加相关，2PY的HR(95% CI)分别为1.64(1.10-2.42)和2.02(1.29-3.18)）；4PY分别为1.89(1.2 6-2.84)和1.99(1.26-3.14)。与2PY和4PY水平显著相关的遗传变异rs10496731的表型分析表明，该变异与可溶性血管黏附分子1(sVC AM-1)水平有关。进一步的Meta分析证实了rs10496731与sVCAM-1的关联。生理水平的4PY处理会诱导VCAM-1的表达与白细胞和血管内皮细胞的黏附。综上，过量烟酸的终末分解产物2PY和4PY都与残留的心血管疾病风险有关，本研究还揭示了4PY和MACE之间临床联系的炎症依赖机制。

1 引言

        CVD是全球发病率和死亡率的主要原因。尽管CVD的治疗和预防取得了重大进步，但残留的心血管疾病风险仍然很高。烟酸（维生素B3）是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)所必需的微量营养素，成年人每天至少需要补充15mg以避免烟酸缺乏综合症(图1a)。在二十世纪初到中期的大萧条期间，由于糙皮病死亡的增加，人们在面粉和其他谷物中强制添加烟酸，这一要求延续至今（图1b）。结果糙皮病死亡人数显著下降，该病的监测最终停止（图1B）。然而随着加工食品和“快餐”食品消费量的增加，膳食烟酸的摄入量持续增加甚至过量（图1B）。最近的调查显示，同时完成饮食和补充剂调查的受访者(n=1,703)报告烟酸摄入过量(37mg(27-50mg))，不到4%的受访者报告每天烟酸摄入量低于15mg。治疗性烟酸(每天1,500-2,500mg)是最早用于治疗血脂异常的药物之一；然而在他汀类药物时代，其降低心血管疾病风险的有效性受到质疑。有临床试验表明，尽管烟酸可以降低低密度脂蛋白胆固醇，但在联合高效他汀类药物治疗时，烟酸并不能降低心血管疾病的风险；相关的meta分析中，烟酸甚至提高了总死亡率。因此，烟酸可能是通过独立于胆固醇的机制影响心血管事件(烟酸悖论)。本研究使用非靶向代谢组学的方法来获得可能导致心血管疾病风险的新代谢物和途径，通过使用非靶向质谱平台来筛选独立于传统预测心血管风险因素的循环小分子。同时本研究探索了过量烟酸的最终分解代谢产物与重大不良心脏事件(MACE)之间的临床、遗传和机制关联。

2 研究设计与方法

        首先通过GWAS研究和全表型组关联分析确定了烟酸代谢物2PY和4PY与心血管疾病风险之间的关联；接着通过体外和体内实验直接检测了这些代谢物对VCAM-1表达的影响；此外，转录组学分析揭示了其他可能受影响的途径。

①临床队列:发现队列(n=1,162；用于非靶向代谢组学分析)和验证队列(n=2,331；用于2PY和4PY的LC-MS/MS分析)使用了克利夫兰诊所GeneBank的样本。排除了在入组前4周内有心肌梗死（MI）或入组时肌钙蛋白I水平升高的个体。MACE被定义为登记后死于任何原因、非致命性心肌梗死或非致命性中风。美国验证队列中，入组时或之前30天内有烟酸使用记录的个人被排除在外。发现队列中，22人(1.9%)的酒精使用数据缺失，2人(1%)的高敏C反应蛋白(HsCRP)水平和当前吸烟状况缺失。美国验证队列中，10人(1%)的血脂资料缺失；9人(1%)的当前吸烟状况缺失；329人(14%)的HsCRP水平缺失。第二个验证队列(欧洲验证队列，n=832)来自接受选择性诊断冠状动脉造影术的患者，1人的HsCRP水平缺失(1%)；398人的教育数据缺失(约48%)；52人血脂谱不完整(约30%)。

②非靶向LC-MS/MS代谢组学：使用亲水作用色谱(HILIC)系统对血浆样本进行非靶向分析；采用Agilent 1290 Infinity LC系统和TripleTOF 5600+质谱仪进行分析；使用MZmine 2和MultiQuant软件进行数据处理。

③使用mummichog算法进行基于网络模块的通路分析，该算法可将具有未确定结构的代谢物映射到通路上。参与同一酶反应的任何两个分子(节点)用一条线(边)相连。在代谢组学中检测到的所有代谢物的病例组和对照组间使用t检验。

④与MACE风险相关的质谱学特征的结构解释：血清代谢物(m/z=153.0656 Da)是2PY和4PY的混合物。2PY和4PY是结构异构体，它们能产生相同的预测m/z。高效液相色谱(HPLC)方法用于验证稳定同位素稀释液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的定量分析。

⑤化学合成2PY和4PY。

⑥靶向LC-MS/MS分析人类血清样本：开发了一种LC-MS/MS法来定量分析人类和小鼠血清中的2PY和4PY。

⑦基因分型和插补。

⑧GWAS和meta分析：对美国验证队列中的血清2PY和4PY浓度自然对数转换后使用线性回归进行GWAS分析，将获得的GWAS结果与公开可用的多种族数据集进行meta分析。利用先前发表的蛋白质组和代谢组学数据集，对与其他性状相关的变异进行Phewas分析。

⑨eQTL分析：meta分析结果和汇总统计数据显示，rs10496731与血清2PY和4PY水平相关。由于ACMSD酶调节色氨酸合成NAD(图1和图6)，本研究推测rs10496731通过调节ACMSD Pre-mRNA的剪接影响2PY和4PY的合成。通过搜索在GTEx项目中rs10496731的eQTLs来检验这一假设。

⑩UK Biobank的遗传分析：使用UK Biobank数据来检验rs10496731与血清sVCAM-1水平(n=51,285)的相关性；使用COX比例风险模型评估rs10496731与事件MACE(心肌梗死、中风或死亡)的关系。

⑪MR分析：为了评估2PY和4PY水平是否与CVD存在因果关系，本研究使用Wald Ratio方法进行了MR分析。暴露的遗传工具是基于meta分析得到的rs10496731对2PY和4PY水平的影响大小。对于结果，效应估计来自我们对英国生物库中具有事件MACE风险的rs10496731的分析，以及那些来自CAD29、MI30和STRKE31的公开可用摘要统计数据。

⑫动物实验：AAV敲除研究：使用携带针对Acmsd mRNA的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒（AAV）在小鼠中敲除Acmsd基因，以评估其对2PY和4PY血清水平的影响。实时定量PCR：从组织或细胞中分离总RNA，并进行逆转录和实时定量PCR分析，以评估2PY和4PY对基因表达的影响。细胞培养：培养了人脐静脉血管内皮细胞，并将其暴露于2PY、4PY或LPS，以评估这些代谢物对VCAM-1表达的影响。免疫组化：对小鼠主动脉进行免疫组化染色，定量分析VCAM-1蛋白的表达。活体显微镜：观察小鼠耳部静脉中的白细胞黏附情况，以评估4PY对血管炎症的影响。实时定量PCR：从组织或细胞中分离总RNA，并进行逆转录和实时定量PCR分析，以评估2PY和4PY对基因表达的影响。免疫印迹：对组织或细胞进行裂解，分析2PY和4PY对蛋白表达的影响。RNA测序：对HUVECs进行RNA测序分析，研究2PY和4PY对血管内皮细胞基因表达的影响。

3 研究结果

①非靶向代谢组学发现残余CVD风险：在接受心脏诊断评估的稳定参与者的队列中，文章对空腹血浆进行非靶向代谢组学分析以确定与MACE相关的候选代谢物，发现了与主要不良心脏事件(MACE)风险增加显著相关的未知代谢物(m/z＝153.0656 Da)(图1a)，并且这种代谢物相对含量较高的个体发生 MACE 的风险增加(图 2a)，与传统的心血管疾病风险因素(图1b)无关。进一步分析显示，该代谢物可能是烟酸/NAD代谢途径中的两种结构异构体(2PY和4PY)的混合物(图2 c和d)。

②烟酸代谢的终末代谢物2PY和4PY的循环水平与残余CVD风险相关：文章采用LC-MS/MS方法，单独定量了烟酸代谢物2PY和4PY(图2d)。在两个不同的验证队列中发现，2PY和4PY循环水平升高与MACE风险增加相关(图3a-d)。在Cox比例风险回归结果中，调整了传统的心血管疾病风险因素后，这种关联依然显著(图3e-h)。进一步敏感性分析表明，2PY与MACE风险的关联在肾功能受损患者中更显著(图3)。

③ACMSD可以调节人类和小鼠的2PY和4PY水平：GWAS研究发现，烟酸代谢物2PY和4PY的代谢水平与2号染色体上ACMSD基因的同一基因座相关(图4a)。2PY 的主要变异(rs10496731)和4PY(rs6430553)彼此之间处于近乎完美的连锁不平衡(图4b和c)。Meta结果显示rs10496731 的特定等位基因T与2PY和4PY水平升高一致相关，并通过改变ACMSD活性来调控这些代谢物的水平(图4d)。并通过小鼠体内实验验证了ACMSD对这些代谢物具有有调节作用(图4e-g)。

④4PY与VCAM-1水平的遗传、临床和功能相关性：文章通过PheWAS探索2PY和4PY水平与MACE风险之间的生物学机制。研究发现，与ACMSD基因变异rs10496731相关的VCAM-1与MACE风险及2PY、4PY循环水平显著相关(图5a和b)，提示它们可能单独或共同通过影响心血管生物标志物影响血管炎症，进而与心脏疾病风险相关联。然而，MR结果未能证明遗传增加的2PY和4PY水平与MACE风险的因果关系。

⑤4PY具有生物活性，会引发血管炎症和白细胞粘附：本研究通过体外和体内实验，探索2PY和4PY对内皮细胞上VCAM-1表达的影响。体外实验结果显示，生理水平的4PY能够促进人内皮细胞上VCAM-1的mRNA和蛋白表达(图5c和d)。体内实验结果表明，4PY能够增加小鼠主动脉内皮细胞上的VCAM-1表达(图5e和f)，并增强白细胞对血管壁的粘附，而2PY没有明显作用(图5g和h)。

4 讨论与总结

        本研究发现烟酸和NAD代谢的两个末端代谢物在临床上都与心血管疾病相关，而不依赖于传统的危险因素，并且这两种代谢物也与血管炎症有关(图6)。烟酸有助于NAD的合成，过量会刺激循环2PY和4PY增加，例如当作为非处方补充剂或作为降胆固醇的药理试剂时(图6)。GWAS研究揭示与循环中的2PY和4PY水平以及sVCAM-1水平显著相关的变异。值得注意的是，直接向血管内皮细胞和小鼠提供4PY，能直接促进血管内皮细胞的激活和VCAM-1的表达。因此，本研究提示过量烟酸的终末代谢产物，尤其是4PY，与MACE风险相关；并可能通过炎症途径(包括VCAM-1表达的直接增强)，促进残余CVD发病。

烟酸是一种常用的非处方药补充剂，也是是第一批降脂药物。有大量研究表明，烟酸代谢产物(2PY和/或4PY)升高，以及相关的血管炎症是否能导致死亡率上升或其他不良事件仍有待确定。烟酸在西方饮食中普遍存在，其饮食参考摄入量因年龄和性别而异。如图6所示，NAD是数百种酶反应中的重要辅因子，由烟酸或色氨酸合成的，其分解代谢产生2PY和4PY。细胞内烟酸/NAD池受到严格调控，有多种合成和降解机制。饮食中的烟酸和色氨酸合成新的NAD。几种酶也可以裂解NAD释放烟酰胺，烟酰胺可以快速回收用于重新合成NAD。然而，在过量的NAD/烟酸库的状态下，烟酰胺被越来越多地分解成最终代谢物2PY和4PY，然后被肾排泄(图6)。此外，我们的基因组分析揭示了2PY和4PY水平与ACMSD的一个变异的关联。综上所述，人类或小鼠的ACMSD遗传降低，导致中间色氨酸代谢物生成喹诺酮、烟酰胺代谢物，最终产生2PY和4PY。与该模型一致，rs10496731的T等位基因也与喹啉酸盐和1-甲基烟酰胺水平的升高显著相关。MR分析没有阳性证据，可能是由于该变异是一种弱的遗传工具。血管炎症是心血管疾病的重要组成部分。美国验证队列中，sVCAM-1也与MACE相关，本文的遗传分析表明，rs10496731也与sVCAM-1水平高度相关。体外和体内功能实验也验证了这些结果。

        本研究还存在一定局限性。在验证队列中只进行了一次2PY和4PY的测量；此外，队列和临床研究仅基于高危欧洲血统人群；临床观察性研究只显示了相关性，而不是因果关系，存在混杂的可能性。为了解决这个问题，本研究对2PY和4PY进行了额外的遗传学、体外和动物模型机制研究，揭示了其与血管炎症的联系，并显示了4PY在体内的直接作用。细胞和体内研究表明，4PY可作为血管炎症和与CVD启动和发病相关的血管表型的驱动因素，需要进行长期研究来测试慢性4PY升高对动脉粥样硬化等表型的影响。总之，本研究提供的证据表明，4PY和MACE风险的临床关联可能源于这种终末烟酸代谢产物和心血管疾病相关表型之间的潜在因果联系。然而2PY和MACE之间的联系似乎受到肾功能的干扰，可能是因为它与4PY高度相关。

        综上所述，目前的研究与现代高效他汀类药物中烟酸的随机临床试验相结合，为“烟酸悖论”提出了一种可能的解释。烟酸诱导的低密度脂蛋白降低，并不能导致心血管风险降低。本研究还提出了一个问题，即由于烟酸的长期安全性问题，特别是在更脆弱的人群中，是否有必要继续规定面粉和谷类食品中添加烟酸值得深思。同时烟酸/NAD补充剂、4PY与动脉粥样硬化性心血管疾病之间的关联尚需进一步研究。

7 参考文献

Ferrell M, Wang Z, Anderson JT, et al. A terminal metabolite of niacin promotes vascular inflammation and contributes to cardiovascular disease risk. Nat Med. 2024 Jun;30(6):1791.]