总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA(snRNA)及核仁小分子RNA(snoRNA)等组成。
miRNAs是小型的、高度保守的RNA分子,如小干扰RNAs (siRNAs),通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达,以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。
进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100~200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。
进行基因结构和功能研究以及基因诊断,通常要求得到的片段长度不小于100~200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。
1、保证核酸一级结构的完整性;
2、排除其它核酸分子的污染,如提取DNA分子时应去除RNA,反之亦然;
3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子;
4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度。
①分析基础研究和疾病研究中的基因表达;
②跟踪对药物治疗的反应(例如,在抗病毒治疗期间和之后监测病毒滴度);
③识别新物种并深入了解进化过程(例如,Ancient DNA分析);
④对人类、动物和植物中引起传染病暴发的病原体进行监测和分类(例如:2019-nCoV检测);
⑤通过微生物检测和量化监测食品和水安全;
⑥诊断疾病(如基因疾病,癌症,免疫学缺陷)。
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子,去除其他不需要的核酸分子,如提取DNA分子时,应去除RNA,反之亦然。
纯化核酸,去除盐类,有机剂等杂质。
溶液型抽提是比较经典的提取方法,几乎都含有去污剂(如 SDS )和盐(如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境,还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA )、维持核酸结构的稳定(如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。
柱式抽提是用于微量核酸分离纯化的较为简单的方法,其基本原理是利用裂解液促使细胞破碎,使细胞中的核酸释放出来。把释放出的核酸特异地吸附在特定的硅载体上,这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力,对其他生化成分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附,因而在离心时被甩出柱子。再把吸附在特异载体上的核酸用洗脱液洗脱下来,分离得到纯化的核酸。
磁珠纯化法与硅胶膜离心柱的原理基本相同,运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性,在 Chaotropic 盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的 DNA 和 RNA 分离出来,但目前来说,价格相对昂贵。

焦碳酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。可以用作抗菌添加剂、组氨酸残基改性剂,以及用于亚胺转变为氨基甲酸酯的试剂。
在溶液中浓度约为 0.1% (v/v) 时可使 RNase 失活,从而防止RNA被降解。
应用:用作RNA酶抑制剂。用于提取RNA。
蛋白酶K是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶,用于生物样品中蛋白质的一般降解。灭活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸,有人使用蛋白酶替代DEPC处理水,蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。在较广的pH范围内均有活性(pH4-12.5)温度范围37-60度盐浓度3mGuHCI或4m尿素中均有活性,在一些去污剂:Tween20 (5%)、Triton X-100 (1%)和SDS (1%)条件下也有活性。蛋白酶K的一般工作浓度是50-100ug/ml。
蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理,尤以DNA样品为佳,如组织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌物、尿、粪便等。
盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂,它并不是一种足够强的变性剂,可以允许完整的RNA从富含Rase的组织中提取出来。核酸提取过程中用于使核酸结合在硅质上,4-8M可断裂氢键,有两种可能机制:
1、变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合,形成变性蛋白-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N-D反应平衡向右移动,随着变性剂浓度增加,天然状态的蛋白不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性;
2、盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用,能形成氢键,当浓度高时,能破坏水的氢键结构,结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂,使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强,盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性。
应用:作为提取细胞总RNA实验中的强烈变性剂。盐酸胍溶液可溶解蛋白质,导致细胞结构破坏,核蛋白二级结构破坏,从核酸上解离下来,此外,RNA酶可被盐酸胍等还原剂灭活。
异硫氰酸胍作为强力的蛋白质变性剂,能迅速溶解蛋白质,导致细胞结构破碎,核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂,在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍,它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。在还原剂存在的情况下,异硫氰酸胍可以断裂氢键。
总RNA抽提试剂常用的是TRIZol法,它可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
TRIZOL的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞,使细胞中的蛋白,核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质,但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase(RNA酶)。
※0.1%的8-羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。
※异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失,导致细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。
※β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。