化学发光、酶免等——辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体
添加时间：2024-07-25
HRP简介
辣根过氧化物酶，英文名Horseradish peroxidase，简称HRP，酶学编号EC1.11.1.7；是从辣根（Amoracia rusticana）中分离出来的，属于过氧化物酶的铁原卟啉基团。辣根过氧化物酶是一组具有一定酶活活性的同工酶，其中辣根过氧化物酶同工酶C（HRP C）含量最高，在辣根的根部含量最为丰富。
HRP结构
辣根过氧化物酶主要由糖蛋白（酶蛋白）和铁(III)原卟啉IX（辅基）组成。它是含有四个二硫键的单链多肽，糖蛋白中糖含量一般是18~22%。糖由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺和半乳糖胺组成，具体取决于特定同工酶。由于辣根过氧化物酶的酶蛋白和辅基分别在紫外波长275nm和403nm下有最大吸收峰，分离得到的HRP都有一个OD403nm/OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）。RZ值的大小表示了酶的纯度，纯度较高的HRP的RZ值一般在3.0以上，RZ值越小，酶纯度越低。
HRP是一组同工酶，由于HRP C含量最高，对HRP C结构研究的也最为详细。HRP C是一组单亚基糖蛋白，包含308个氨基酸残基和8个糖链，每分子HRP C中有2分子Ca2+、1分子铁(III)原卟啉IX辅基和4对二硫键，相对分子质量约为44 000 道尔顿，包括多肽链（33 890道尔顿）、氯化血红素加Ca2+（约700道尔顿）和碳水化合物（约9 400道尔顿）。至少存在7种HRP同工酶。辣根过氧化物酶同工酶的等电点范围为3.0-9.0。辣根过氧化物酶的作用机制，酶学特性，等电点等都与其结构息息相关。HRP易与过氧化氢（H2O2）结合，而所得的[HRP-H2O2]络合物可氧化各种氢供体生成自由基和水。供氢体有很多，如芳香族化合物，酚类，吲哚，胺类和磺酸盐类等。在实际应用中，供氢体DH2多选择溶液为无色的物质，通过反应生成有色物质.D，从而通过对反应后溶液颜色深浅的测定，来得到需要的数值。由于供氢体多种多样，针对不同的供氢体，HRP反应的最适pH都不太一样，最适pH大多数在6.0-6.5而酶在5.0-9.0的pH范围内最为稳定。反应的温度一般就是常温25℃左右。HRP可以通过几种不同的方法与抗体结合，包括戊二醛，高碘酸盐氧化，通过二硫键，以及通过氨基和巯基定向交联剂。它比酶标记β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶更小且更稳定，因此是最理想的标记。此外，它的糖基化会导致更低低的非特异性结合。当与底物一起孵育时，辣根过氧化物酶可产生标记分子的有色、荧光或发光衍生物，从而可实现定量。辣根过氧化物酶已被证明可略微降低cydAB突变体中的抑制水平。已知的抑制剂包括叠氮化钠、氰化物、L-胱氨酸、重铬酸盐、亚乙基硫脲、羟胺、硫化物、钒酸盐、对氨基苯甲酸以及Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+以及Pb2+离子。
HRP应用
由于HRP性质稳定，天然来源丰富，且分子量小，容易制得活性较高的纯酶，所以应用较为广泛。1、HRP是目前在ELISA中应用最为广泛的标记用酶之一，主要是因为其容易制得，价格相对较低，且性质稳定，耐热和有机溶剂，与抗原或抗体偶联后，活性损失很小。2、HRP还可用于化学发光检测、用于免疫印迹和免疫组织化学实验、与葡萄糖氧化酶联用，用以检测葡萄糖含量等。3、 HRP也常用与污水处理。工业废水中含有大量的苯酚，双酚A等分类和芳香胺类化合物，等环境污染较大，HRP可以将这些污染物作为底物，氧化成自由基，自由基在聚集成沉淀聚合物，从而大大降低对环境的污染。4、 HRP近几年来被研究用作食品添加剂。由于HRP本身无毒无害，反应条件温度，反应易控制，近年来被研究用于食品的保鲜，解毒和检测等领域。
单位定义
一个连苯三酚单元将在20℃、pH 6.0条件下，在20秒内从连苯三酚形成1.0mg的红棓酚。
分析说明
RZ(Reinheitszahl)是指溶于去离子水中的酶(0.5–1.0 mg/ml)的吸光度比值A403/A275。它是血红素含量的量度，而不是酶活性。即使是RZ值较高的制剂也可能具有较低的酶活性。
HRP相关底物
邻联茴香胺, peroxidase substrate、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺、鲁米诺钠盐、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐、愈创木酚, oxidation indicator、N-(6-Aminohexyl)-N-ethylisoluminol、5-氨基水杨酸、4-氨基安替比林、4-氨基邻苯二甲酰肼、3-氨基-9-乙基咔唑。
1、透析抗体
吸取2mg抗体到透析袋中，将抗体浓度调整为（4mg/mL），在20 mM的碳酸盐缓冲液（pH=9.5）中透析3h，每 1h 换液一次。如果原抗体中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，必须透析除去。
2、氧化HRP
称量4mg HRP溶于0.2ml水中(20 mg/ml),称量 Nai04 37.9mg 溶于1.895ml 水中(20mg/ml)，HRP与 Nai04体积比 1:1 混合 (即各取200ul 混合，缓慢搅拌)，4 ℃避光静置反应30min，此时溶液为绿色。
3、终止氧化
加4ul乙二醇到40ul水中，混后全部加入氧化好的HRP中（缓慢搅拌）。4℃避光静置反应30min，此时溶液为褐色。
4、标记抗体
将终止氧化的 HRP溶液直接加入到透析好的抗体中混匀， 4 ℃避光反应4h。
5、终止标记
称取0.2mg的NaHB4，溶解于40 ul水中（现配现用），全部加入上述反应液中，4℃避光反应1h，每10min 摇一次。
6、纯化保存
20 mM PBS（pH=7.4）4℃避光透析过夜。然后在标记液中加入等体积的甘油，混匀后-20℃保存。纯化抗体-HRP标记物，也可选择 酶标纯化剂 进行纯化。经过验证通过酶标纯化剂 纯化，标记物测试性能更好，且纯化时间仅需要半个小时，当天完成标记操作，避免过夜透析纯化。
